Øvelsen gikk ut på å danne seg et oversikt på PCR (Polymerase Chain Reaction) og spesielt primer konstruksjon ved hjelp av aktuell software tilgjengelig på internett.

Polymerase Chain Reaction er en metode for amplifisering av et spesifikt område av DNA, slik at man kan produsere nok DNA til å teste. Denne teknikken kan benyttes for å identifisere bl.a. sykdomsfremkallende virus/bakterie, døde personer, eller personer mistenkt av en forbrytelse. Polymerase kjedereaksjon ble utviklet av Kary Mullis i 1985. Det er en syklisk prosess der en DNA sekvens fordobles i hver syklus. For å kunne benytte PCR teknikken må man kjenne den nøyaktige sekvensen som ligger til venstre og høyre for den biten man ønsker å amplifisere. Man utnytter det faktum at alle organismer har DNA sekvenser (gener) som er unike til den organismen.

Amplifiseringen skjer ved simultan primer forlengelse av komplementære DNA strenger.

DNA ( deoksyribosenukleinsyre) er arvematerialet i de fleste levende organismer. DNA’s stabile tilstand er en dobbelheliks som består av to antiparallel løpende DNA-enkeltstrenger. Enkeltstrengene er sukkermolekyler (deoksyribose) som er forbundet gjennom fosfatgrupper. En base sitter på hver deoksyribose molekyl og det er hydrogenbindinger mellom basene som binder to komplementære DNA-strenger sammen. Basene er cytosin (C) og guanin (G), som holdes sammen av 3 hydrogenbindinger og adenin (A) og tymin (T), som holdes sammen av 2 hydrogenbindinger. Det er denne forskjellen i bindingsenergi som må tas hensyn til i konstruksjon av primerpar for utførselen av PCR metoden.

Polymerase er enzymet som katalyserer dannelse av en DNA dobbelstreng. Enzymet benytter seg av en allerede eksisterende DNA enkelstreng som templat og setter inn komplementære nukleotider. dATP, dGTP, dCTP og dTTP (kalles dNTP’er) benyttes som substrat . Den komplementære DNA-strengen vokser i 5´® 3´ retning i DNA-syntese. For å kunne starte prosessen trengs en primer. Primeren er et lite DNA-stykke som er bundet til DNA-templatet. Primeren er altså start-punktet for replikasjon. PCR metoden hadde begrenset bruksområde inntil man fant at DNA polymeraser fra varmestabile organismer kunne benyttes.

I PCR metoden amplifiserer man en del av genet som man ønsker å påvise. Målet med amplifiseringen kan dekke et bredt spekter, bl.a.

• Diagnose av genetiske sykdommer og kreft
• Rask deteksjon av saktevoksende mikroorganismer og viruser
• Probe preparering
• Forberedelse av sekvenstemplat
• "Directed mutagenesis"

Startmaterialet for PCR er en DNA matrise, varmeresistent DNA polymerase, dNTP’er, et passende primerpar samt buffer og en MgCl₂ løsning. Mg²⁺ er nødvendig som koenzym.

• Trinn 1 : Reaksjonsløsningen oppvarmes til ca. 95° C i noen minutter slik at DNA denaturerer og danner enkeltstrenger.
• Trinn 2: Temperaturen senkes til ca. 37-65° C i ca. 1 min. Temperaturen er avhengig av primersammensetningen. I dette trinn bindes primerne til templatet.
• Trinn 3: Temperaturen heves til den optimale temperaturen for enzymet slik at den komplementære DNA vokser i 5'®3´ retning. Temperaturen holdes i 7 min slik at man er sikker på at polymerasen er ferdig.

------Representerer 1. Trinn

------Representerer 2. Trinn

------Representerer 3. Trinn

  Bildet er lånt fra Http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html

Som sagt tidligere fordobles DNA sekvensen i hver syklus. Etter 4. runde (syklus) formeres de to komplementære genstykkene,

eksponensielt. Det er denne sekvens man kaller målsekvensen eller amplikonet. Man har følgende algoritme for antall av enkel-streng amplikoner tilstede etter n-sykluser.

# amplikoner = 2 * (2ⁿ-n-1)

I produktblandingen har man også amplikoner som ikke er avgrenset av primere:

Disse vokser lineært med antall sykluser.

Total # ikke-avgrenset amplikoner = 2n

Polymeraser

Polymeraser har, i vanlige celler en optimal arbeidstemperatur på ca. 37˚C og brytes ned ved ca. .Funn av varmestabile polymeraser har revolusjonert arbeid i amplifikasjon av DNA. Varmestabil polymerase kan motstå de temperaturer som er nødvendig for å lime på primeren slik at replikasjonen kan skje. Disse varmestabile enzymer ekstraheres enten direkte fra organismer som holder til i varmekilder eller fremstilles genteknologisk. Thermus aquatic (Taq) og Thermus thermophilus (Tth) er to av de forskjellige organismer som benyttes. De forskjellige polymeraser har ulik halveringstid, prosessivitet, arbeider med ulik hastighet og kan også ha en reverstranskriptase aktivitet. Det siste gjør at man er i stand til å lage cDNA fra RNA/mRNA. At polymerasene varierer så mye med hensyn til disse egenskapene gjør at man må være forsiktig i valg av polymerase type avhengig av bl.a. egenskapene til DNA matrisen man jobber med og lengden av amplikonet.

Deoksynukleosidtrifosfater (dNTP’er) er nødvendig for energi og syntese av DNA. dNTP’er fås i handelen enten som fire separate løsninger (10mM) eller allerede blandet. Både dNTP’er og primer bør være med i stort overskudd slik at syntesetrinnet kan kjøres i syklus ved at det nylaget DNA denatureres ved oppvarming.

Passende 10 X reaksjonsbuffer sendes som oftest sammen med polymerase og med separate løsninger av 25 mM MgCl₂. Mg²⁺-ioner danner et løselig kompleks sammen med dNTP’er som er viktig for innbygging av nucleotidene. Mg²⁺ ioner stimulerer i tillegg polymeraseaktivitet og øker smelte-temperaturen for DNA-dobbelheliksen og bindingen mellom primerne og DNA-matrisen. Det er nødvendig å optimalisere Mg²⁺ konsentrasjon. Feil konsentrasjon kan føre til tilleggsprodukter eller lavere utbytte av ønsket produkt.

DNA som er framstilt fra ulik type vev eller organismer kan benyttes. Man kan i tillegg kjøpe genomisk DNA fra produsent. Templatkonsentrasjonen bør ikke være for høy for å unngå at sekvenser som ikke er avgrenset av primer vokser raskere enn lineært. DNA burde i tillegg være intakt over lengden som skal amplifiseres. Dersom DNA’en er degradert kan kun kortere områder amplifiseres. Det er i tillegg viktig at inhibitorer til reaksjonen ikke er tilstede. Disse kan f.eks være detergent, EDTA eller fenol. Det er svært viktig at man har fullstendig denaturering av DNA før PCR begynner (93-95ºC i 5 min.)

Valg og konstruksjon av primerpar er viktig fordi primerne definerer det fragmentet man ønsker å amplifisere. For å kunne konstruere et primerpar må man kjenne DNA sekvensen av det genområdet man ønsker å klone. En rekke universiteter og forskningsinstitusjoner tilbyr gratis adgang til DNA informasjon for sekvenserte gener.

• NCBI
• Swiss Prot
• Embl
• Osv.

Programvaren som vi benyttet for å konstruere primere var Primer 3 som finnes på Http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.

Den optimale lengden av primerne er ca 20-30 nukleotider. I prinsippet kan man velge et hvilket som helst punkt på genet men følgende momenter bør passes på:

.

Man får, ved bruk av Primer 3 for konstruksjon av primere, mulighet til å sette en del betingelser for forskjellige egenskaper til det ferdige produktet samt begrensinger til søksområde i det aktuelle genet.

Primer3 Output (primer3_www_results.cgi v 0.2)Primer3 Output

No mispriming library specified

Using 1-based sequence positions

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

LEFT PRIMER 1164 20 60.15 50.00 7.00 0.00 gcctgggacccaattatctt

RIGHT PRIMER 1366 20 59.95 55.00 3.00 2.00 gaatctccgcacttctccag

SEQUENCE SIZE: 2264

INCLUDED REGION SIZE: 2264

PRODUCT SIZE: 203, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

1141 ctatcctgacactcaccgccatcgcctgggacccaattatcttcatatacctgtgaactg

1201 tccctaccgtgctcgagtggccaactaccagcgtgatggcccgatgtgcatgcaggacaa

1261 tcagggtggtgctccaaattactaccccaacagctttggtgctccggaacaacagccttc

1321 tgccctggagcacagcatccaatattctggagaagtgcggagattcaacactgccaatga

Primer3 Output (primer3_www_results.cgi v 0.2)Primer3 Output

No mispriming library specified

Using 1-based sequence positions

OLIGO start len tm gc% any 3' seq

LEFT PRIMER 602 20 59.81 45.00 6.00 0.00 tgcacatatggtacccgaaa

RIGHT PRIMER 801 20 60.01 60.00 4.00 1.00 ggaactgcactagcctctgg

SEQUENCE SIZE: 4167

INCLUDED REGION SIZE: 4167

PRODUCT SIZE: 200, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

541 tgcaagatactttacatcagtgagtgtaaaaaatccttgccgggatcaggtgaaaaatct

601 ctgcacatatggtacccgaaaaaacaaccaatactgtctcaactggcttttgtcgtatgt

661 ttttcctgccttttgggaaatggaatagtcacacacacatggatatactatacgtatcgg

721 gtcaatgtgaacagcatctgcagcccgatcaaaaattcccattggccgtcgcgttcacat

781 tccagaggctagtgcagttccaaaaaaaaaaatcgctacgtttatctgacgagcagagag

Har valgt å inkludere et område kjent som intron. Det kan ofte være hensiktsmessig å velge et område med kjente introns. Man vil da være i stand til å sammenligne kjente konsentrasjoner av DNA med ukjent konsentrasjon av RNA. De amplikoner som er laget på DNA matrisen vil være større enn amplikoner av RNA.

Primer3 Output

No mispriming library specified

Using 1-based sequence positions

OLIGO start len tm gc% any primer3_www_results_help.cgi - PRIMER_THREE 3' seq

LEFT PRIMER 2908 20 59.91 55.00 2.00 2.00 ccaccacaacaaccactacg

RIGHT PRIMER 3606 20 59.63 50.00 8.00 2.00 cttgcctgcagtgcatttag

SEQUENCE SIZE: 4167

INCLUDED REGION SIZE: 4167

PRODUCT SIZE: 699, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00

TARGETS (start, len)*: 3100,5

2821 gacgaggatcttctcctactccgacacgcagcgccaccgcctcggaccaaactacctgct

2881 gcttccgcccaacgcgcccaagtgcgcccaccacaacaaccactacgacggcttcatgaa

2941 cttcatgcaccgcgacgaggaggtcgactacttcccatcccgctacgatcctgccaagca

3001 cgccccccgctaccccatcccctccgccaccctcaccggccgccgcgagaaggtaattct

3061 gttgattgatttgcgtttggtttttacatttcactatattttctttcttaattactactt

3121 cccccgtttcagattataagatgttttaattttagtcaatctcaaactataagtttaact

3181 aagtttatagataaatatagtaataattacaacaccaaattagtttcattaaatcattaa

3241 atctatagttcaatatatttattatgagttaaaaatgttactattttttatataaactta

3301 gtcaaatttaaaacagtttaattttgaccaaagttaaaacgatttataatctaaaacagg

3361 agaagtagtaatagctagtcaatttattaactggttttgatcgatcgggttgcgagtgca

3421 ggtggtgattgccaaggagaacaacttcaagcagccaggggagaggtaccgttcatggga

3481 tccggcaaggtatgtacacacatgcagatgcagcaaccgaattaactgtcgagagactga

3541 actaaactgaattagtcaactagactgattgactgatgaacaaatgctaaatgcactgca

3601 ggcaagaccggttcatcaagagatggatcgacgcactctctgaccctcgcctcacccacg

tttct målsekvens

 agaagt intronsekvens