Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction, PCR, er en teknikk for å amplifisere spesifikke områder av DNA ved bruk av enzymkatalysert DNA-syntese.
DNA, det genetiske materialet i cellen, er utformet som en dobbeltrådet spiralstruktur av to komplementære, antiparallelle polynukleotider. Hvert polynukleotid er bygget opp av nuklotider. Nukleotider er nukleosider (sukkeret deoksyribose pluss en nitrogenbase) bundet sammen av fosfatgrupper (fosfodiesterbindinger). Polynukleotidene er bundet sammen hydrogenbindinger mellom nitrogenbasene. Det er to typer nitrogenbaser i DNA; pyrimidinbasene tymin (T) og cytosin (C) og purinbasene adenin (A) og guanin (G). A bindes normalt alltid til T ved to hydrogenbindinger, og G til C ved tre hydrogenbindinger. Når man skal konstruere primerpar til PCR må man ta hensyn til denne forskjellen i bindingsenergi.
Startmaterialet for PCR er et templat som inneholder sekvensen som skal amplifiseres, amplikonet. Videre trengs et passende primer-par, dNTP, en varmestabil DNA polymerase og buffer med MgCl2.
Templat:
Templatet kan være genomisk DNA, RNA, klonet DNA eller et PCR-produkt.
Trenger bare en liten mengde av templatet til PCR.
DNTP:
dNTP (deoksynukleotidtrifosfater: dATP, dGTP, dTTP og dCTP) er nødvendig for DNA-syntesen (de er substrat for polymerasen).
Fås kjøpt som fire separate løsninger eller ferdigblandet.
De enkelte dNTP’ene må tilsettes reaksjonsblandingen i samme forhold.
dNTP’ene må være i overskudd i reaksjonsblandingen.
DNA polymerase:
DNA polymeraser er enzymer som katalyserer dannelsen av en DNA dobbeltråd. Enzymet beveger seg langs en allerede eksisterende DNA enkeltråd og setter inn korrekte nukleotider. For at enzymet skal kunne binde seg til DNA enkeltråden, må en primer (et lite DNA stykke) allerede være bundet til DNA enkeltråden.
For å unngå at DNA polymerasen bli inaktiv ved de høye temperaturene som brukes under PCR, benyttes varmestabile DNA polymeraser. De blir enten direkte ekstrahert fra mikroorganismer som holder til i varme kilder eller fremstilt genteknologisk. De viktigste kommer fra følgende organismer: Thermus aquaticus (Taq), Thermococcus litoralis (Vent) og Pyrococcus furiusus (Pfu). Disse polymerasene har ulik halveringstid, prosessivitet, arbeider med ulik hastighet (antall innebygde nukleotider pr. sek.) og kan ha reverstranskriptaseaktivitet.
Buffer og MgCl2:
10 x Reaksjonsbuffer leveres sammen med DNA polymerasen.
Mg2+ ioner danner sammen med dNTP’ene et løselig kompleks som er viktig for innebyggingen av nukleotidene.
Mg2+ stimulerer polymeraseaktivitet.
Ved for høy Mg2+ konsentrasjon kan man få tilleggsprodukter utover amplikonet man ønsker å klone.
Mg2+- konsentrasjonen må optimaliseres for hver PCR-reaksjon.
Primer:
Primerparet definerer det området på DNA som man ønsker å amplifisere.
Lengden til en primer er mellom 18 og 30 baser, den optimale lengden er ca. 20 baser.
Primerne må være i overskudd i reaksjonsblandingen.
Alle de fire basene (A, T, C og G) bør være like mye representert i primerne for å unngå at noen primere bindes bedre enn andre (mellom C og G er det tre hydrogenbindinger, mellom A og T er det bare to hydrogenbindinger).
For å hindre primer-primer-annealing, må primerne ikke være komplementære til hverandre.
For å hindre selv-annealing, må primerne ikke være selv-komplementære.
DNA-strukturer med utpreget sekundærstruktur bør unngås slik at begge primerne bindes like lett.
Primerne bør ikke ha 3’ T siden primere med 3’ T har større sjanse for mismatch.
Primerne bør ha minst en A eller en T i tripletten nærmest 3’-enden.
Smeltetemperaturen til primerne i et primer-par bør være omtrent den samme.
PCR er en syklisk prosess (figur 1), og kan deles inn i 3 trinn.
Først varmes reaksjonsløsningen opp til ca. 94°C i noen minutter for å denaturere DNA dobbeltråden til enkeltråder (initiell denaturering).
Trinn 1: Primer-binding: temperaturen senkes til 30°C - 65°C i ca. 30 sekunder for at primerne skal kunne binde seg til de komplementære områdene på DNA enkeltrådene.
Trinn 2: DNA-syntese: temperaturen heves til 65°C - 75°C i 2-5 minutter (optimaltemperaturen for DNA polymerasen som brukes). DNA polymerasen danner nå ny DNA tråd ved å putte inn korrekt nukleotid.
Trinn 3: Denaturering: temperaturen heves igjen til 94°C , men denne gang bare for noen sekunder. DNA dobbeltrådene separeres.
Trinn 1-3 gjentas 25-30 ganger.
PCR utføres i spesielle PCR maskiner hvor temperaturprofilen og antall sykluser lett kan defineres.
Fig.1: PCR syklusen.
DNA sekvensen varmes opp for å separere trådene (initiell denaturering).
Deretter går reaksjonsblandingen gjennom repeterte sykluser med primer-binding, DNA syntese og denaturering
Figur 2: Amplifisering av DNA-sekvens; tre PCR-sykluser
En DNA-sekvens (blå + grønn) amplifiseres ved hjelp av primere (røde)
som er komplementære til endene til DNA-sekvensen.
For hver syklus dobles DNA-sekvensen.
Vi får:
Totalt antall enkelt-tråder avgrenset av primer-paret (
og 
) etter n sykluser,
er 2 ´
(2n- n - 1).
Totalt antall enkelt-tråder som ikke er avgrenset av
primerne (
og 
) etter n
sykluser, er 2 ´ n.