Øving 3

ØVING 3

Bioinformatikk TES 8047

Oppgave:

Gi en oversikt over PCR og Primer3.

PCR

PCR står for Polymerase Chain Reaction og er en teknikk for å amplifisere spesifikke områder av DNA.

Reaksjonen krever templat, primere, deoksynukleotidtrifosfater, DNA polymerase og buffer med MgCl₂.

Prosessen er syklisk, og DNA-sekvensen vil dobles for hver syklus.

PCR er en rask, billig og enkel teknikk, og den anvendes derfor på mange forskjellige områder som klinisk kjemi, rettsmedisin og forskning.

Vil du lese mer om PCR, kan du klikke her.

Primer3

Primer3 er et program som konstruerer primere til PCR-reaksjoner. Programvaren fins på http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi.

Primerne programmet konstruerer er blant annet testet med hensyn på smeltetemperaturen, størrelsen, GC-innholdet, muligheten for primer-dimer dannelse og størrelsen på PCR-produktet. Brukeren kan benytte programmets default-verdier for å plukke ut et optimal primer-par eller spesifisere verdien på forskjellige kriterier selv.

Når man skal konstruere primer-par er det viktig å være klar over følgende momenter:

Den optimale lengden til primere er på 20-30 baser.
Alle de fire basene (A, T, C og G) bør være like mye representert i primerne for å unngå at noen primere bindes bedre enn andre (mellom C og G er det tre hydrogenbindinger, mellom A og T er det bare to hydrogenbindinger).
For å hindre primer-primer-annealing, må primerne ikke være komplementære til hverandre.
For å hindre selv-annealing, må primerne ikke være selv-komplementære.
DNA-strukturer med utpreget sekundærstruktur bør unngås for at begge primerne skal bindes like lett.
Primerne bør ikke ha 3’ T siden primere med 3’ T har større toleranse for en mismatch.
Primerne bør ha minst en A eller en T i tripletten nærmest 3’-enden.
Smeltetemperaturen til primerne i et primer-par bør være omtrent den samme.

Primer3 velger primere med lengde så nær den optimale lengden som mulig (default-verdi: 20 baser) og med smeltetemperatur så nær den optimale smaltetemperaturen som mulig (default-verdi: 60°C).

Primer konstruksjon ved hjelp av Primer3

Jeg valgte basesekvensen til 3-metyladenin DNA glykosylase fra Rattus norvegicus og Arabidopsis thaliana, og brukte disse sekvensene til å teste ut to av mulighetene Primer3 gir når man skal konstruere primere: ekskludere og innkludere områder. Resultatene er gjengitt nedenfor sammen med en link til det opprinnelig Primer3-resultatet (Primer3, Primer picking result).

NB: Når en DNA sekvens av et gen spesifiseres, er det sekvensen av ikke-templat DNA som spesifiseres og som skrives i 5’® 3’ retning fra venstre mot høyre.

Organisme: Rattus Norvegicus

Genprodukt: 3-metyladenin DNA glykosylase

Det beste resultatet fra primer-søket med default-verdier ble:

Oligo start lengde tm gc% sekvens

Venstre primer 175 20 60.08 55.00 ACAGTCAGAGCAGCAGCAGA (binder seg til templat-DNA: 3’® 5’-tråden)

Høyre primer 374 20 59.68 50.00 CACGGAGTTCTGTTCCATCA (binder seg til ikke-templat-DNA: 5’® 3’-tråden)

Sekvens størrelsen: 963

Størrelsen på området som er inkludert: 963

Produktstørrelsen: 200

1 CTCTAAAGAACCGGTGTCCGTGGTGCTCCCCGACGCCGAGCACCCTGCATTTCCTGGACG

61 AACCCGCCGCCCAGGGAATGCCAGAGCAGGATCCCAAGTGACCGGATCTCGTGAGGTCGG

121 CCAGATGCCAGCGCCGCTTTCACGAAAGATCGGGCAAAAAAAGCAGCAACTGGCACAGTC

181 AGAGCAGCAGCAGACCCCTAAGGAGAAACTCTCTTCGACCCCTGGCCTCCTGCGAAGTAT

241 CTACTTCTCGAGCCCAGAGGACCGCCCTGCCCGGCTAGGACCGGAGTATTTTGACCAGCC

301 CGCAGTCACCCTAGCCCGTGCATTTCTGGGACAGGTCCTTGTCCGGCGACTTGCTGATGG

361 AACAGAACTCCGTGGGCGCATTGTAGAGACTGAGGCATACTTGGGGCCAGAAGACGAAGC

421 TGCCCACTCAAGGGGTGGCCGGCAGACCCCCCGTAACCGTGGCATGTTCATGAAACCTGG

481 AACTCTGTACGTGTACCTCATCTATGGCATGTACTTCTGCTTGAATGTCTCCAGTCAAGG

541 GGCTGGGGCTTGTGTCTTGCTAAGAGCACTAGAGCCATTGGAGGGCCTAGAGACCATGCG

601 GCAGCTTCGAAACTCCCTCCGGAAAAGCACTGTCGGCCGTTCCCTCAAGGACCGCGAGCT

661 CTGTAATGGTCCCTCCAAACTGTGCCAGGCCCTAGCCAGGAGTAAGAGCTTTGACCAGCG

721 AGACCTGGCCCAAGATGAGGCTGTGTGTGGCTGGAGCATGGCCCTCTGGAGTCCAGCAGC

781 CAGCTGTGGTGGCGGCAGCCGCAGGTATTGGCCATGCAGGGGAATGGACACAGAAGCCCT

841 TGCGCTTCTATGTCCAGGGCAGCCCATGGGTCAGTGTGGTAGATAGAGTGGCTGAACAGA

901 TGTATCAGCCTCAGCAAACAGCGTGCTCTGATTGTTCAAAAGTAAAATAAATAACTTGTT

961 TGT

Link til Primer3 "PRIMER PICKING RESULT" for Rattus norvegicus, default verdier

Hvis man ønsker å ekskludere et område, kan man merke av dette området på sekvensen og gjøre et nytt primer-søk. Jeg valgte å ekskludere en del av det området som ble valgt som det beste området for primer-binding når default-verdiene benyttes. Resultatet ble at programmet tvinges til å velge et annet primer-område.

Organisme: Rattus Norvegicus

Genprodukt: 3-metyladenin DNA glykosylase

Det beste resultatet fra primer-søket med et ekskludert område ble:

Oligo start lengde tm gc% sekvens

Venstre primer 278 20 59.79 50.00 GGACCGGAGTATTTTGACCA (binder seg til templat-DNA: 3’® 5’-tråden)

Høyre primer 472 20 59.85 50.00 CATGAACATGCCACGGTTAC (binder seg til ikke-templat-DNA: 5’® 3’-tråden)

Sekvens størrelsen: 963

Størrelsen på området som er inkludert: 963

Produktstørrelse: 195

Ekskludert område (start, lengde): AGCAGC (186,6)